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高通量測序技術（High-throughput Sequencing）是一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，又稱下一代測序技術（Next-Generation Sequencing）、二代測序技術，其使得可對一個物種的基因組和轉錄組進行深入、細致、全貌的分析，所以又被稱為深度測序（Deep Sequencing）。

第二代測序技術的核心思想是邊合成邊測序（Sequencing By Synthesis），即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列。

文庫構建：文庫構建即為測序片段添加接頭。無論是PCR產生的片段還是基因組鳥/槍法打斷的片段都具有特異性（PCR中不同樣品反向引物插入了特異性的barcode，因此兩端也是特異的），兩端缺乏必要的引物因此混合DNA/片段不能直接擴增和測序。DNA/片段需要加接頭修飾才能進行上機測序，這個過程稱為二代測序的文庫構建。